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卵黄蛋白（vitellin，Vn）是一种高密度糖脂蛋白，是所有雌性卵生动物卵黄的主要成分，在卵黄发生期迅速积累，储存在卵中，是胚胎和幼体早期发育主要的营养来源。卵黄蛋白原（Vtg）是卵黄蛋白的前体，在生长发育期间，卵泡内发生的不同分子事件会影响Vtg的摄取。
为探究细胞连接是否与Vtg摄取的调节有关，奥塔哥大学动物学系通过RNAseq比较了野生鳗鱼卵黄发生前期（PV）和卵黄发生早期（EV）卵巢组织的转录组，以研究编码可能参与调节Vtg摄取的细胞连接蛋白的特异性基因的表达。研究结果发表于Cells，文章题为“Are Cell Junctions Implicated in the Regulation of Vitellogenin Uptake? Insights from an RNAseq-Based Study in Eel, Anguilla australis”。
研究设
计研究设计
研究团队从埃尔斯米尔湖捕获野生短鳍鳗，根据形态学特征，鉴定出PV和EV鳗鱼，解剖后称重卵巢和肝脏，分别计算性腺指数（GSI）和肝体指数（HSI）。并对卵巢碎片进行组织学分析，确认性腺阶段。
从卵巢碎片中提取总RNA，构建链特异性cDNA文库（MGIEasy RNA Directional library Prep Set V2.1，华大智造），进行高通量测序。具体地，首先通过oligo-dT 选择（oligo(dT) 磁珠富集Poly(A) mRNA）富集样本中的mRNA，然后进行片段化和逆转录；在接头连接和PCR扩增后，将cDNAs压缩成DNA纳米球，以便在DNBSEQ平台上对100bp的成对reads进行测序。
随后，对测序数据进行生物学分析，在注释的转录组上搜索编码构成细胞连接的蛋白质的目标基因，检查目标基因的差异表达并推导对应于Vtg受体候选的蛋白质序列。
1. 卵巢发育阶段的特征
从PV到EV阶段，GSI、HSI和OD显著增加。由于脂滴和卵黄蛋白（Vtg掺入）的大量积累，EV卵母细胞尺寸明显增大，而PV卵母细胞仅显示少量脂滴，且在其细胞质中没有 Vtg 积累的迹象。
2.De Novo转录组及其下游分析
在DNBSEQ平台上对每个样本平均1425万个100bp的成对末端reads进行测序。结果显示，从头组装产生了171,620个推测基因的282,469个转录本，其中25.6%被功能注释。过滤掉低表达基因后，保留了32,447个基因，其中20,810个基因得到了功能注释，占比64.1%。初始聚类分析显示：样本聚集成两个不同的表型组，PV和EV。
GO富集分析还反映了PV和EV阶段之间转录的差异。在PV-EV转化过程中，3个生物学过程（内吞作用、膜组织、阳离子跨膜转运调节)和1个分子功能(钾通道抑制剂活性）被上调。在每个GO类别中有超过15项被下调，主要与RNA代谢和卵壳形成有关，其中下调最多的GO项中，膜的整体成分及相同的蛋白结合包含编码紧密连接（TJ）组成蛋白的基因（图1）。最终，4878个基因差异表达;从PV发展到EV阶段时，2851个基因表达上调，2027个基因表达下调。
PV-EV之间的转录差异
3. PV-EV转化过程中细胞连接的基因表达
RNAseq数据被进一步用于研究哪些基因可能参与促进该物种主动积累Vtg的能力。结果显示，在已鉴定的25个编码不同类型TJ组成蛋白的基因中，有7个是差异表达的；在PV-EV转变过程中，有2个基因上调，5个基因下调，这支持Vtg进入卵磷脂受到颗粒细胞层内紧密连接（TJ）网络的限制。与此相反，只有5个GJs在卵巢中表达，且阶段之间的表达没有显著变化，因此间隙连接（GJ）参与调节Vtg摄取的化学屏障假设不受支持。
4.PV-EV转化过程中受体介导的内吞机制和Vtg加工相关基因的表达
利用RNAseq数据检测与Vtg识别相关的基因的表达，网格蛋白介导的内吞和囊泡运输的分子机制，以及Vtg蛋白分解。在澳洲鳗从头转录组中发现了两个编码假定Vtg受体的基因（lr8，lrp13），这两个基因在PV-EV转变过程中均无差异表达；而编码网格蛋白介导的内吞和囊泡运输的基因在PV-EV转化过程中明显上调，这表明它们也可能是蛋白质到达卵膜后调节Vtg积累的重要因素。因此，基因表达模式可能有助于确定与Vtg摄取调节相关的合适候选者，为澳洲鳗提供新的序列数据。
结语
综上，基于对卵巢组织不同阶段转录本丰度的比较分析为研究卵母细胞生长的分子事件和生理途径提供了有价值的信息，可在未来研究中进一步探究。其中，基于DNBSEQ平台进行的RNAseq比较分析在筛选调节Vtg摄取基因方面发挥了重要作用。MGIEasy RNA Directional Library Prep Set可将10 ng - 1 μg Total RNA制备成适合于MGI高通量测序仪测序的文库，用于链特异性RNA测序，准确确定转录的DNA模板链信息，发现更多反义转录本，获得更准确的转录本注释信息。此外，该文库制备试剂还可搭配不同RNA富集方法及不同测序读长，兼容多种物种样本（包括人、动物、植物、微生物等），适用不同样本类型项目需求（轻微降解RNA、FFPE样本和血液样本）的基因表达和转录组研究。
参考文献：
Babio L, Lokman PM, Damsteegt EL, Dutoit L. Are Cell Junctions Implicated in the Regulation of Vitellogenin Uptake? Insights from an RNAseq-Based Study in Eel, Anguilla australis. Cells. 2022 Feb 4;11(3):550. doi: 10.3390/cells11030550. PMID: 35159359; PMCID: PMC8834532.
（本文来源测序中国，作者：maisuier）
