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国家疾控中心领衔,基于DNBSEQ多平台联合发表猴痘病毒快速测序策略

时间:2023-12-26作者:华大智造阅读数:526分享

导读:

猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)是一种长度为197kb的双链DNA病毒,由大约200个基因组成,可在人类和野生动物中引起疾病。近年来,人类猴痘病例逐渐增多,已成为全球关注的焦点。


核酸扩增和血清学检测能以低成本快速诊断猴痘病例,但这些检测不能用于监测MPXV的来源、谱系、传播和基因组变异。新出现的变异可能会使得样本中的病毒载量被低估,甚至导致误诊。为了更好地开展MPXV感染的预防和治疗,有必要制定具有成本效益和高质量的MPXV全基因组测序策略。


近日,来自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、重庆市疾病预防控制中心、华大智造等单位的研究团队在Virologica Sinica期刊发表了题为“Rapid identification of full-length genome and tracing variations of monkeypox virus in clinical specimens based on mNGS and amplicon sequencing”的文章。研究团队利用多种测序平台对获取的猴痘病例样本开展了mNGS(宏基因组测序)和扩增子测序及对比分析,并对这些平台的周转时间和所需成本进行了估算。研究显示,采用华大智造研发的DNBSEQ-G99进行扩增子测序的覆盖率达99.66%,能够对临床样本进行快速测序,从而促进获得高质量的MPXV基因组序列。


值得注意的是,该研究采用了DNBSEQ-G99测序平台具备的多时点数据输出模式(Bioanalysis by Sequencing, BBS),可在2小时内完成初始数据处理并给出分析报告,在12小时内获得完整病毒基因组,大大缩短了MPXV测序所需的时间,具有成本效益和高效率。BBS技术由中国疾病预防控制中心与华大智造联合研发,并于2021年公布。


文章发表在Virologica Sinica



多种策略结合获取MPXV基因组信息


MPXV基因组测序的主要策略是宏基因组和扩增子测序。MPXV只占临床样本总DNA的一小部分(不到1%),为了对MPXV基因组进行测序,必须从临床样本中分离病毒并进行培养,然后再进行基因组测序。病毒分离耗时且需要严格的条件。相反,扩增子可用于富集或扩增病毒核酸。在这项研究中,研究团队利用宏基因组和扩增子测序方法来准确鉴定MPXV的完整基因组。扩增子测序成本低和效率高,使得临床样本能够快速测序,从而有助于获得高质量的MPXV基因组序列。



扩增子测序


在扩增子测序中,使用ATOPlex平台对猴痘参考基因组(NC_063383.1)设计PCR引物(含739对扩增子,扩增子长度:313-395bp),并进行猴痘病毒的基因组扩增,使用MGIEasy Fast PCR-Free FS DNA library Prep Kit制备扩增子测序文库,在DNBSEQ-G99平台上采用SE100+10+10测序策略对文库进行测序。



宏基因组测序


在mNGS中,完成测序文库制备步骤后,将制备的DNB加载到规则阵列载片上,在华大智造测序平台DNBSEQ-G99(BBS模式,PE100+10+10)和DNBSEQ-G400*(PE100+10+10)上进行测序。



BBS技术助力快速生成高质量MPXV基因组



在传染病防控中,特别是未知病原体的鉴定,时间至关重要。研究团队估计了上述分析所需的时间。对比周转时间,在扩增子测序及分析中, DNBSEQ-G99为12小时;


在mNGS中,DNBSEQ-G99为12小时。在扩增子数据集中, DNBSEQ-G99的10×覆盖率最高,为99.66%,在mNGS数据集中,DNBSEQ-G99、DNBSEQ-G400*测序水疱液样本的10×覆盖率最高分别为99.93%、99.99%。


DNBSEQ-G99的多时点数据输出模式(bioanalysis by sequencing, BBS),可缩短交付时间,该系统可在运行后2小时内完成初步分析,并在12小时内完成PE150测序,新技术的应用大大缩短了MPXV测序所需的时间,在极致快速的基础上更快一步,且测序读长不受限,更加适用于公卫系统紧急多元的检测场景。对于病毒载量较低的口腔拭子样本(Ct=27.81),也能够在12小时内获得完整的病毒基因组序列。


总体分析来看,DNBSEQ-G99的耗时短,覆盖率高,reads数量大,可满足MPXV基因组测序需求。考虑到成本,研究团队认为,mNGS适用于对疱液等高病毒载量样本进行测序,其应用于口咽拭子等低病毒载量样本会导致成本过高。扩增子测序是提高基因组质量同时显著降低费用的一个有效方法。


值得一提的是,在该研究中,研究团队采用DNBSEQ-G99成功地对2022年9月中国内地报道的第一例输入性猴痘病例以及2023年6月初发现的一例病例进行了突变分析,并对病毒基因组进行了溯源分析。2022年9月,刚刚发布的华大智造基因测序仪DNBSEQ-G99,首次应用于传染病防控,助力该次溯源测序得到了高度可信的毒株序列全长。



结语


该研究表明,目前的主流测序平台能够满足MPXV全基因组测序的要求,并准确识别样本中的基因组变异位点。病毒感染样本测序策略的选择应结合样本数量、预期持续时间和成本等因素仔细考虑。对于高病毒载量的样本,如水疱液,mNGS和扩增子测序都可以产生高质量的全长病毒基因组。对于病毒载量较低的样本,如口咽拭子,由于需要大量的测序数据,因此不建议直接进行mNGS,成本较高,扩增子测序可高效地对临床样本进行测序且成本较低。


研究团队将各种新的测序技术与扩增子富集策略相结合。即使对于低病毒载量的口腔拭子样本,也能使用DNBSEQ-G99在运行后2小时内完成初步分析,在12小时内获得完整的病毒基因组序列,大大缩短了MPXV测序所需的时间,为监测变异和对MPXV等重要病原体发出早期预警提供了重要帮助。


针对新发未知病原体的快速识别和溯源需求,华大智造基于自主研发的试剂、仪器和软件打造了病原微生物高通量测序产品组合,覆盖从样本到报告输出全流程,是猴痘病毒识别和溯源的理想工具。该产品组合可兼容DNBSEQ-G99、DNBSEQ-E25、MGISEQ-200和MGISEQ-2000等测序仪, 文库制备与数据分析均实现了自动化操作。华大智造独有的DNBSEQ技术,为病原体的识别和溯源保障高质量的测序数据。



华大智造病原微生物测序产品组合


1.扩增子测序方案


ATOPlex多重PCR技术开发的猴痘病毒扩增子测序Panel,含739重PCR引物,覆盖病毒全长基因组,可对病毒进行相对定量,用于猴痘病毒的快速鉴定和溯源。


MPXV分析软件具备猴痘病毒的鉴定,变异检测以及株系分型等功能,能够快速、准确的对测序数据进行分析。


2.mNGS方案


使用MGIEasy Fast FS DNA Library Prep set对样本进行文库制备,通过高通量测序技术,可以对样本中未知病原进行鉴定和溯源。


PFI分析软件可以对未知病原进行快速鉴定,MGAP分析软件,可以对病原进行基因组组装等分析。


靶向测序(Targeted Next-Generation Sequencing,tNGS)因其针对特定基因或基因区域进行深度测序的能力而备受关注。tNGS主要分为基于引物 PCR扩增的扩增子测序和基于探针杂交的杂交捕获测序两种方法。


病原靶向测序(tNGS)在病原微生物检测上比较热门,主要是将多重PCR扩增与测序技术结合,能够对待测样本中几十种至几百种病原微生物及其毒力和/或耐药基因进行检测。


华大智造ATOPlex平台采用自主研发的单管超高重PCR技术,可提供个性化的多重PCR引物池,以及包括对应的扩增体系在内的一整套靶向建库试剂。在靶向测序方面,表现出优异的性能,现已全面覆盖DNA、RNA和甲基化靶向捕获三个方向,适用于分子育种、遗传病研究、公共卫生等多种方向的应用。


* 本文部分转载自测序中国;点击文末“阅读原文”,查看文章链接

* DNBSEQ-G400,国内产品名为MGISEQ-2000

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